Anticorpos conformacionais para PKCs clássicas e suas aplicações / Conformational antibodies against classical PKCs and their applications

A família proteína quinases C (PKC) é composta por dez isoenzimas, as quais são capazes de fosforilar resíduos de serina e treonina. A ativação dessas quinases envolve mudanças conformacionais, como a remoção do pseudo-substrato do sítio ativo e associação dessas enzimas com lipídeos em membranas biológicas. Além disso, três fosforilações são importantes para a maturação/ enovelamento da enzima e não estão associadas com o estado de ativação das cPKCs. Apesar dessas quinases estarem envolvidas em vários processos patológicos, como carcinogênese e doenças cardiovasculares, ainda não se estabeleceu a relação entre estado de ativação das PKCs com essas doenças. Isso se deve, em parte, à ausência de ferramentas que possibilitam a distinção das formas ativas e inativas das PKCs. Na presente tese, baseando-se em mudanças conformacionais sofridas pelas PKCs durante o processo de ativação, dois anticorpos contra cPKCs ativas foram racionalmente desenvolvidos, sendo um anticorpo policlonal (anti-C2Cat) e outro monoclonal (4.8E). O anticorpo anti-C2Cat foi desenvolvido a partir de imunização de coelhos com um peptídeo localizado na região de interação entre os domínios C2 e catalítico na PKC inativa. Já o anticorpo monoclonal 4.8E foi produzido após a imunização de camundongos Balb/ C com extrato de proteínas proveniente de células HEK293T superexpressando formas constitutivamente ativas da PKCßI. A seletividade de anti-C2Cat e 4.8E por cPKCs ativas foi demonstrada por ensaios de ELISA e de imunoprecipitação, sendo que os anticorpos sempre apresentaram maior afinidade por cPKCs ativas purificadas, superexpressas ou mesmo as endógenas. O anticorpo anti-C2Cat foi capaz de monitorar a dinâmica espaço-temporal da ativação das cPKCs em linhagens de neuroblastoma (Neuro-2A e SK-N-SH) estimuladas com PMA, morfina, ATP ou glutamato por diferentes tempos. Ainda, um maior conteúdo de cPKCs ativas foi detectado por anti-C2Cat na linhagem de câncer de mama MDA-MB-231 (triplo- negativa) do que em células MCF-7 (ER+). Em acordo com esses dados, anti-C2Cat identificou uma maior ativação de cPKCs em tumores mais agressivos de câncer de mama (subtipo triplo-negativo) do que em tumores menos agressivos (ER+, subtipo luminal). Os anticorpos conformacionais anti-C2Cat e 4.8E foram aplicados para elucidar vias de sinalização que levam à carcinogênese em células MDA-MB-231, por meio da realização de ensaios de co-imunoprecipitação, seguida pela identificação das proteínas por espectrometria de massas. Usando essa abordagem, os resultados sugerem que as cPKCs ativas possam estar envolvidas com a tradução de proteínas envolvidas na migração celular, como actina. Em conjunto, os resultado obtidos na presente tese demonstram duas formas racionais de desenvolver anticorpos contra cPKCs ativas, sendo que algumas aplicações para estas ferramentas foram demonstradas. Estratégias baseadas em mudanças conformacionais, similares às apresentadas aqui, poderão ser utilizadas para a produção racional de anticorpos contra outras quinases ou proteínas

The protein kinase C family (PKC) is composed of ten isoenzymes, which are capable of phosphorylating serine and threonine amino acid residues. PKC activation involves conformational changes, such as removing the pseudo-substrate from the active site and binding of the enzyme to lipids in biological membranes. In addition, PKC undergoes three phosphorylations that are important for the maturation/ folding of the enzyme and are not linked with activation status. Despite the fact that these kinases are involved in various pathological processes, such as carcinogenesis and cardiovascular disease, a relationship between PKC activation status with these diseases has not yet been established. This is partly due to the lack of tools to detect active PKC in tissue samples. In this thesis, based on conformational changes suffered by PKC during its activation, two antibodies against active cPKCs were rationally developed; a polyclonal antibody (anti-C2Cat) and a monoclonal (4.8E). Anti-C2Cat was produced after immunization of rabbits with a peptide located at the interface between the C2 and catalytic domains of cPKCs in an inactive PKC. The monoclonal antibody 4.8E was produced after immunization of Balb/C mice with total lysates from HEK293T cells overexpressing constitutively active forms of PKCßI. The anti-C2Cat and 4.8E specificity by active cPKCs was demonstrated by ELISA and immunoprecipitation assays, where the antibodies always showed higher affinity to active cPKCs. Anti-C2Cat was able to detect the temporal and spatial dynamics of cPKC activation upon receptor (morphine, ATP or glutamate) or phorbol ester stimulation in neuroblastoma lines (Neuro-2A and SK-N-SH). Futhermore, anti-C2Cat is able to detect active PKC in human tissues. Higher levels of active cPKC were observed in the more aggressive triple negative breast cancer tumors as compared to the less aggressive estrogen receptor positive tumors. Also, both antibodies were applied to study signaling pathways that lead to carcinogenesis in MDA-MB-231 cells by performing co-immunoprecipitation and mass spectrometry. Using this approach, the results suggest that active cPKCs may be involved in translation of proteins involved in cell migration, such as actin. Taken together, the results obtained in this thesis showed two rational ways to develop antibodies against active cPKCs and some applications for these tools were demonstrated. Strategies based on conformational changes, similar to those presented herein may be used for rational production of antibodies against other kinases and proteins

Modelagem molecular aplicada à elucidação dos mecanismos envolvidos na ação antiproliferativa e hemolítica das alquilfosfocolinas / Molecular modeling applied to the elucidation of the antiproliferative and hemolytic mechanisms of action of alkylphosphocholines

As alquilfosfocolinas (APC) são uma classe de fármacos derivados de fosfolipídios endógenos que apresentam potencial antitumoral. Diferentemente de outros fármacos antitumorais que agem no DNA da célula, as APCs têm como primeiro local de ação a membrana plasmática e proteínas de sinalização, como a PKC. O objetivo desse trabalho é elucidar, através de metodologias computacionais, os possíveis mecanismos de ação das APCs que provocam hemólise, inibição da PKC e interação com membranas celulares. Inicialmente, a toxicidade de um conjunto de 34 APCs foi estudada pelos métodos quimiométricos de Análise de Agrupamentos Hierárquicos (HCA) e Componentes Principais (PCA). As moléculas foram simuladas com dinâmica molecular (DM) e propriedades físico-químicas e estruturais foram calculadas para os confôrmeros de menor energia. Após aplicação de HCA e PCA, as APCs foram divididas em 3 grupos, de acordo com suas características estruturais. Os resultados sugerem que a presença de grupos catiônicos volumosos, ou anéis como adamantila e ciclohexila, aumentam a hemólise de compostos de cadeia alquílica longa. Anéis macrocíclicos como ciclopentadecila parecem ser importantes para o potencial hemolítico de compostos com cadeia alquílica curta. Com relação a compostos sem anéis e de cadeia linear, grupos catiônicos menos volumosos parecem favorecer a hemólise. Na próxima etapa do estudo, 7 derivados de APC, com diferentes grupos catiônicos, foram selecionados e ancorados no domínio C2 da PKCα. O intuito foi mapear resíduos de aminoácidos importantes para a interação dos ligantes com a enzima, e comparar com o modo de ligação do ativador endógeno fosfatidilserina (PS). Mais uma vez, HCA e PCA foram aplicados para extrair informação relevante do mapeamento. Os resultados mostraram que as cadeias laterais de Pro188, Asn189, Arg216, Trp247, Asp249 e Thr250 não permitem a aproximação adequada do ligante, o que impede que a porção fosforila se coordene com um dos átomos de cálcio. A porção catiônica da PS, em contrapartida, consegue estabelecer ligação-hidrogênio com Asn189 de forma a posicionar os oxigênios da fosforila para interagir, ao mesmo tempo, com o átomo de cálcio. Com menos pontos de coordenação, a afinidade de ligação do cálcio pela PKCα diminui e a ativação da enzima fica comprometida, interrompendo toda a cascata de sinalização que depende dela. A parte final desse trabalho se dedicou ao estudo da interação da miltefosina com diferentes bicamadas lipídicas sob o ponto de vista termodinâmico. Oito bicamadas de diferentes fosfolipídios foram simuladas por DM e a interação energética da miltefosina foi calculada por Umbrella Sampling. Os resultados mostraram que a miltefosina apresenta maior partição em bicamadas contendo colesterol, sendo a miscibilidade nesses sistemas cerca de 76 vezes maior que os valores encontrados para bicamadas sem colesterol. Além disso, verificou-se que a internalização da miltefosina é mais fácil em regiões contendo lipídeos poli-insaturados, provavelmente devido ao empacotamento mais frouxo da bicamada. Os dados sugerem que a miltefosina age principalmente em rafts lipídicos e que células contendo mais lipídicos poli-insaturados podem incorporar maior quantidade do fármaco

Alquilfosfocolines (APCs) comprise a class of drugs with antitumor activity derived from endogenous phospholipids. Differently from other drugs whose primary site of action is the DNA, APCs act firstly in the plasma membrane and signaling proteins, such as PKC. The main objective of this work is to elucidate, via computational approaches, the possible mechanisms of actions that cause hemolysis, PKC inhibition and interaction with cellular membranes. Initially, a set of 34 APCs was studied by means of Hierarchical Cluster Analysis (HCA) and Principal Component Analysis (PCA). The molecules were simulated by means of molecular dynamics simulations (MD) and molecular and structural properties were calculated for the lowest-energy conformer. After HCA and PCA methodologies, the set was divided into 3 groups according to their structural features. The findings suggest that the presence of bulky cationic moieties, or the adamantyl and cyclohexil rings, increase the hemolytic potential of compounds with long alkyl chains. Macrocyclic rings, such as cyclopentadecyl, seem to be important to elevate the hemolysis of compounds with short alkyl chains. Regarding linear carbon chain derivatives with no ring substitution, less bulky cationic head groups seem to favor hemolysis. In the next step of this work, 7 APC derivatives were selected and docked in the C2 domain of PKCα. The aim now was to map the residues relevant for ligands interaction compared to the binding mode of the endogenous activator, phosphatidylserine (PS). HCA and PCA were again applied in order to extract relevant information from the mapping. The results showed that the lateral chains of Pro188, Asn189, Arg216, Trp247, Asp249 and Thr250 do not allow the proper approximation of the ligands, impeding the phosphoryl moiety from coordinating with one of the calcium atoms. On the other hand, the cationic moiety of PS forms hydrogen-bonding with Asn189 in order to position the oxygens to interact, at the same time, with a calcium atom. With less coordination sites, calcium binding affinity diminishes and the enzyme activation is compromised, interrupting the signaling cascade. The final part of this work was dedicated to the study of miltefosine interaction with different lipid bilayers from the thermodynamics standpoint. Eight bilayers were simulated with MD and the energetic interaction was calculated via Umbrella Sampling simulations. The findings showed that miltefosine has higher partition in bilayers containing cholesterol, with miscibility of about 76 times higher than the values referring to bilayers without cholesterol. Moreover, it was observed that the internalization of miltefosine is facilitated in regions containing polyunsaturated lipids, probably due to the looser packing. The data suggest that miltefosine acts primarily in lipid rafts, and that cells containing more polyunsaturated lipids in their membranes can incorporate higher quantities of this drug

Signaling pathways in cerebral vasospasm / Vias sinalizadoras em vasoespasmo cerebral

Cerebral vasospasm is a deadly complication following the rupture of intracranial aneurysms. One new development in the experimental treatment of cerebral vasospasm is the looming target of signaling pathways. The pathogenesis of cerebral vasospasm involves multiple signaling pathways in proliferation, inflammation, cell death, smooth muscle phenotype changes, vascular remodeling, and contraction. A review of all of these areas is beyond the scope of this article, and as such, three systems that mediate these vascular responses have been selected: the tyrosine kinase-MAP kinase pathway, the sphingosine-1-Rho myosin light chain kinase pathway and protein kinase C.

O vasoespasmo cerebral é a complicação mais grave após a ruptura de um aneurisma intracraniano. Um novo foco experimental de tratamento de vasoespasmo cerebral são as vias sinalizadoras. A patogênese do vasoespasmo cerebral envolve múltiplas vias de sinalização na proliferação, inflamação, morte celular, alterações fenotípicas da muscultura lisa, remodelamento vascular e contração. Uma revisão de todas essas áreas é o objetivo deste artigo, e três sistemas que comandam essa resposta vascular foram selecionados: a via da tirosina quinase-MAP quinase, a via esfingosina-1-Rho miosina quinase e a proteína quinase C.